Javascript is momenteel uitgeschakeld in uw browser.Verschillende functies van deze site werken niet als javascript is uitgeschakeld.open toegang tot wetenschappelijk en medisch onderzoekOpen access peer-reviewed wetenschappelijke en medische tijdschriften.Dove Medical Press is lid van de OAI.Bulk herdrukken voor de farmaceutische industrie.We bieden onze auteurs echte voordelen, waaronder een snelle verwerking van papers.Registreer uw specifieke gegevens en specifieke geneesmiddelen die u interesseren en we zullen de informatie die u verstrekt koppelen aan artikelen uit onze uitgebreide database en pdf-kopieën onmiddellijk naar u e-mailen.Terug naar tijdschriften » International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease » Volume 17Auteurs Zhang L, Li D, Chang C, Sun YGepubliceerd 24 september 2022 Volume 2022:17 Pagina's 2383—2399DOI https://doi.org/10.2147/COPD.S377226Beoordeling door enkele anonieme peer reviewRedacteur die publicatie heeft goedgekeurd: Dr. Richard RussellLijiao Zhang, Danyang Li, Chun Chang, Yongchang Sun Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Peking University Third Hospital, Beijing, 100191, Volksrepubliek China Correspondentie: Yongchang Sun, e-mail [e-mail beveiligd] Doelstelling: skeletspierdisfunctie is een belangrijke comorbiditeit bij patiënten met chronische obstructieve longziekte (COPD), en wordt geassocieerd met een slechte kwaliteit van leven en verminderde overleving, maar de betrokken mechanismen blijven ongrijpbaar.Ferroptose is een nieuw ontdekt type celdood als gevolg van ijzerafhankelijke ophoping van lipidenperoxide.Het doel van deze studie was om te onderzoeken of ferroptosis betrokken is bij COPD-geassocieerde skeletspierdisfunctie.Methoden: Een muismodel van COPD werd vastgesteld na 24 weken blootstelling aan sigarettenrook (CS), en mRNA-sequencing, hematoxyline-eosine (H&E) kleuring, immunokleuring (IF), RT-PCR en Western blot werden gebruikt om de veranderingen te identificeren in de gastrocnemius-spieren.In vitro werden C2C12-myotubes behandeld met CS-extract (CSE) en geëvalueerd op ferroptosis-gerelateerde moleculen.De routes die ferroptosis reguleren, werden vervolgens onderzocht in door CSE gestimuleerde myotubes.Resultaten: Vergeleken met controles vertoonden COPD-muizen een verrijkte ferroptose-route.Gpx4 was verlaagd, terwijl hypoxie-induceerbare factor (Hif) 2α was verhoogd, op gen- en eiwitniveau.Een verlaagd niveau van GSH, maar verhoogde celdood, Fe2+, lipide ROS, LPO en 4-HNE werden waargenomen bij COPD-muizen of in CSE-gestimuleerde C2C12-myotubes, die kunnen worden verbeterd door ferroptosisremmers.De expressie van myostatine (MSTN) was verbeterd in COPD-muizen en CSE-gestimuleerde myotubes.MSTN reguleerde HIF2α-expressie en leidde tot ferroptose in myotubes, terwijl remming van MSTN-binding aan zijn receptor of remming / knock-down van HIF2α resulteerde in verminderde celdood en gedeeltelijk herstelde GPX4 en GSH.Conclusie: blootstelling aan CS veroorzaakte ferroptose in vivo en in vitro.Mechanistisch gezien verhoogde CS-blootstelling MSTN, wat verder ferroptose door HIF2α in skeletspieren induceerde, wat kan bijdragen aan spierdisfunctie door de metabole capaciteit te verminderen en het aantal spiervezels te verminderen, wat een potentieel nieuw therapeutisch doelwit voor COPD-gerelateerde skeletspierdisfunctie onthult.Sleutelwoorden: chronische obstructieve longziekte, skeletspierdisfunctie, ferroptosis, myostatine, hypoxie-induceerbare factor 2αChronische obstructieve longziekte (COPD) is een wereldwijd voorkomende chronische luchtwegaandoening en is wereldwijd de derde doodsoorzaak.1 Als een zeer heterogene ziekte die meestal wordt geassocieerd met het roken en ouder worden van sigaretten, wordt COPD beschouwd als een systemische ziekte met meerdere intra- - en extrapulmonale comorbiditeiten, waarvan sommige onafhankelijk van COPD optreden, maar waarvan sommige causaal verband kunnen houden met COPD.1 Sarcopenie/skeletspierdisfunctie is een van de belangrijke comorbiditeiten van COPD en heeft een significante impact op de kwaliteit van de patiënten van leven, ernst van de ziekte, ziekenhuisopname en mortaliteit.2–4 De prevalentie van skeletspierdisfunctie bij patiënten met stabiele COPD was van 14,5%2 tot 55%.5 Skeletspierdisfunctie komt vaker voor bij personen met emfyseem, en significanter bij onderste ledematen, wat de ambulante capaciteit van de patiënten schaadt, wat leidt tot ongebruikte spieratrofie, waardoor een vicieuze cirkel ontstaat.4 In tegenstelling tot onomkeerbaar destructief longlijdenHet inherente aanpassingsvermogen van skeletspieren biedt therapeutische mogelijkheden om skeletspierdisfunctie bij COPD-patiënten aan te pakken.6 De mechanismen van COPD-gerelateerde skeletspierdisfunctie zijn echter nog niet volledig opgehelderd.Een aantal signaalroutes kan betrokken zijn bij of bijdragen aan COPD-gerelateerde skeletspierdisfunctie, zoals proteasoom-gemedieerde ubiquitine-afhankelijke eiwit katabole route (ubiquitine-proteasoom route),7 autofagie-lysosoom route,8 NF-KB en inflammatoire cytokines ,9 en de myostatine (MSTN)-Smad3-route,7 waaronder de ubiquitine-proteasoomroute overheerst bij spierproteolyse.Als belangrijke spierspecifieke E3-ubiquitine-ligasen, mediëren spierspecifiek Ringvinger 1-eiwit (MuRF1, ook bekend als TRIM63) en Atrogin1 (ook bekend als FBXO32) spierproteolyse, en verlies van beide kan spieratrofie verlichten.10 Bovendien kan In perifere spieren van COPD-patiënten werd een trage tot snelle vezeltransformatie gevonden, resulterend in een verslechtering van het antivermoeidheidsvermogen van de skeletspieren en een verminderd aeroob metabolisme.4Ferroptose is een vorm van ijzerafhankelijke en gereguleerde celdood die wordt gekenmerkt door accumulatie van reactieve zuurstofspecies (ROS) en massale lipideperoxidatie (LPO)-gemedieerde celmembraanbeschadiging.11 Glutathion (GSH)-glutathionperoxidase 4 (GPX4)-as speelt een beschermende rol bij ferroptose die kan worden veroorzaakt door moleculen die de biosynthese van GSH of GSH-afhankelijke antioxidantenzymen remmen.11 GSH, de meest voorkomende endogene antioxidant in zoogdiercellen, wordt gegenereerd uit cysteïne dat in zijn geoxideerde vorm cystine kan worden verkregen via de amino antiporter-systeem Xc− (een transmembraan eiwitcomplex bestaande uit lichte keten subeenheid SLC7A11 en zware keten subeenheid SLC3A2), of in zijn gereduceerde vorm cysteïne van methionine via de transsulfuratieroute.12 Wanneer GSH onvoldoende is, leidt overmaat peroxide tot LPO .Ongebreidelde LPO is het kenmerk van ferroptosis, waarbij ijzer essentieel is.Skeletspieren bevatten 10-15% van het totale ijzergehalte van het menselijk lichaam.Er is bevestigd dat overmatige ijzeraccumulatie de normale cellulaire functie zou kunnen verstoren door oxidatieve stress en de katalyse van giftige hydroxylradicalen.13Cellulaire veroudering wordt momenteel beschouwd als een belangrijk mechanisme dat ten grondslag ligt aan de pathogenese van COPD, en sigarettenrook (CS) kan werken als een inductor van veroudering.14 Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat ferroptose betrokken is bij de ontwikkeling en/of progressie van veel ouderdomsziekten. gerelateerde ziekten,15 en dat leeftijdsgebonden ijzeraccumulatie is gevonden in de skeletspieren van zowel diermodellen van sarcopenie als oudere patiënten.16Daarom speculeren we op basis van dit bewijs dat ferroptose mogelijk betrokken is bij de pathogenese van COPD-gerelateerde skeletspierdisfunctie.Daarom onderzochten we ferroptose en de potentiële moleculen die betrokken zijn bij de regulatie ervan in skeletspieren van COPD-muizen veroorzaakt door CS-blootstelling en in een in vitro model.We ontdekten dat blootstelling aan CS ferroptose induceerde in skeletspieren van muizen en in C2C12-myotubes.CS-blootstelling verhoogde de expressie van MSTN, die ferroptose induceerde via HIF2α in skeletspiercellen.Deze bevindingen onthulden een nieuw mechanisch verband tussen COPD en skeletspierdisfunctie.Leeftijd-gematchte C57BL/6-muizen (6-8 weken oud) werden gekocht bij Beijing Vital River Laboratory of Charles Rivers Laboratories en bewaard in een geventileerde, specifieke pathogeenvrije dierfaciliteit.Alle dierbehandelingen en procedures zijn goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Peking (nr. LA2021545) volgens de Chinese richtlijnen voor welzijn en ethische beoordeling voor laboratoriumdieren.Alle muizen werden gehuisvest op een 12 uur:12 uur licht/donker cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water.Het muismodel van COPD werd vastgesteld met behulp van een blootstellingsmethode voor roken met alleen de neus, zoals eerder gerapporteerd. minuten per keer, met rookvrije intervallen van 20 minuten, 5 dagen per week, gedurende 24 weken met een rookblootstellingssysteem met alleen neus (SG-300; SIBATA, Tokyo, Japan).Sigaretten werden actief verbrand en rook werd gegenereerd door een computergestuurde afzuiging, met 20 ml rook per 8 seconden in de belichtingskamer.De optimale rook:luchtverhouding van 1:9 werd verkregen.De controlemuizen werden blootgesteld aan gefilterde lucht.Na 24 weken blootstelling aan CS ondergingen de muizen longfunctietests en morfometrische beoordeling van longsecties om de succesvolle modellering van COPD te verifiëren.De longfunctie van muizen werd uitgevoerd door ademhalingsapparatuur voor dieren (AniRes2005, Bolan Technology, Beijing, China).In het kort werden muizen verdoofd door intraperitoneale injectie van 3% pentobarbital-natrium (0,6 mg/10 g).Er werd een tracheotomie uitgevoerd en een canule werd in de larynxtrachea ingebracht.De muizen werden geventileerd met een ademvolume van 10 ml/kg, een ademhalingssnelheid van 500 ademhalingen/min en een positieve eind-expiratoire druk van 2 cmH2O.Geforceerde vitale capaciteit (FVC), geforceerd expiratoir volume in 0,1 s (FEV0.1), geforceerde expiratoire flow bij 25% van FVC (FEF25%), FEF75%, FEF25-75%, longcompliantie en de weerstand van long (RL ) werden gemeten.18De grijpkrachttest werd uitgevoerd om de spierkracht van vier ledematen van de muizen te meten met behulp van een grijpkrachtmeter (unibiolab, Beijing, China).De muis greep de gaasstaaf die met alle vier de ledematen was verbonden met een krachttransducer.Vervolgens werd de muis met een constante snelheid aan de staart teruggetrokken totdat de greep werd losgelaten.De piekkracht (g) werd automatisch geregistreerd door de transducer.Elke muis werd 4 keer getest, met een rustinterval van 2 minuten tussen elke test.Het gemiddelde van vier metingen werd geregistreerd als grijpkracht.Na de longfunctietest werd de bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) verzameld voor fluorescent-activated cell sorting (FACS).Vervolgens werden de muizen opgeofferd door cervicale dislocatie.Longweefsels en gastrocnemius-spieren van de achterpoten werden 24 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde en werden vervolgens ingebed in paraffine.Het longweefsel werd in plakjes gesneden met een dikte van 5 m voor H & E-kleuring.Vervolgens werden de gemiddelde lineaire interceptie (MLI) en destructieve index (DI) van longweefsel geëvalueerd voor de mate van emfyseem, in navolging van onze vorige studie.19 Specifiek werd MLI gemeten met behulp van een raster van 100 × 100 μm dat willekeurig door de longblaasjes ging. en berekende de totale lengte van elke lijn van het raster gedeeld door het aantal alveolaire intercepts.De meting van DI werd uitgevoerd door een raster met 42 punten in het midden van haarlijnkruisen bovenop het longveld.Structuren die onder deze punten liggen, werden gemarkeerd als normale (N) of vernietigde (D) alveolaire en/of kanaalruimten.Punten die op de andere constructies vallen, zoals kanaalwanden en alveolaire wanden, zijn niet meegenomen in de berekeningen.DI werd berekend als D/(D+N).De 10 m dikke doorsneden werden door een cryostaat (Leica, Solms, Duitsland) uit de in paraffine ingebedde gastrocnemius-spier gesneden en werden gekleurd met H & E.In paraffine ingebedde skeletspierweefsels werden gesneden tot een dikte van 5 µm.Vervolgens werden de paraffineglaasjes van paraffine ontdaan en opnieuw gehydrateerd door een reeks gegradeerde alcoholen totdat water werd gebruikt.De objectglaasjes werden onderworpen aan antigeenwinning in een thermostatisch waterbad, gedurende 15 minuten bij 95 °C, en ze werden gedurende 30 minuten geblokkeerd met 5% geitenserum in TBST bij kamertemperatuur.De monsters werden vervolgens overnacht geïncubeerd met 1000-voudig verdunde primaire antilichamen in blokkerende buffer bij 4°C, gevolgd door 3 keer wassen met 1xPBS, incubatie met 1000-voudig verdund secundair antilichaam (geiten-anti-konijn-IgG (H+L ) sterk kruisgeadsorbeerd secundair antilichaam-Alexa Fluor 647) en DAPI in blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en 3 keer gewassen met 1 × PBS.De primaire antilichamen omvatten anti-slow skeletal myosine heavy chain (MyHC) primair antilichaam (GB111858, Servicebio, Wuhan, China), anti-4 hydroxynonenal (4-HNE) primair antilichaam (ab46545, Abcam, Cambridge, VK), anti-GPX4 primair antilichaam (AF7020, Beyotime, Shanghai, China) en DAPI (Beyotime, Shanghai, China).De expressie van langzame skelet MyHC, 4-HNE en GPX4 in skeletspieren werd afgebeeld onder een fluorescentiemicroscoop.Sigarettenrookextract (CSE) werd bereid zoals eerder vermeld.20 CSE werd bereid door de rook van 5 sigaretten (teer 10 mg, nicotine 0,9 mg, CO 12 mg) door 10 ml serumvrij celkweekmedium te borrelen.De 5 sigaretten werden gerookt met een constante luchtstroom, die 5 minuten duurde voor elke sigaret.Vervolgens werd het verkregen extract de PH op 7,4 ingesteld en door een poriënfilter van 0,22 m (Merk Millipore, Massachusetts, Duitsland) gefiltreerd.De concentratie van 100% werd berekend met UV-absorptie 4.0 bij 320 nm.CSE werd vers bereid en binnen 30 minuten gebruikt.De muis C2C12-myoblasten (ATCC, Manassas, VS) werden gekweekt bij 37 ° C met 5% CO2 in DMEM (ThermoFisher, Massachusetts, VS), 10% FBS (ThermoFisher, Massachusetts, VS), 2 mM L-glutamine, 100 IE /mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine (ThermoFisher Scientific).Toen de C2C12-myoblasten groeiden tot 70-80% confluentie, werd het kweekmedium overgeschakeld naar een differentiatiemedium dat bestond uit DMEM, 2% paardenserum (Thermofisher, Massachusetts, VS), 100 IE / ml penicilline en 100 g / ml streptomycine .Na 5 dagen differentieerden de meeste myoblasten in myotubes.Onze eerdere onderzoeken hadden aangetoond dat de concentratie van CSE onder de 3% geen significante effecten had op de levensvatbaarheid van C2C12-myotubes17, dus bij latere experimenten werd 3% als de optimale effectieve dosis genomen.In de celkweek werden C2C12-myotubes ook behandeld met geïndiceerde middelen, waaronder transformerende groeifactor (TGF)-β-receptor-activerende kinase (ALK) 4/5-blokker TEW-7197 (S7530, Selleck, Shanghai, China), ferroptose-remmer UAMC-3203 (S8792, Selleck, Shanghai, China), hypoxie-induceerbare factor (HIF) 2α (400087, Merk Millipore), recombinant MSTN (120-00-10, Dogesce, Beijing, China) en vehikel (dimethylsulfoxide, DMSO) .Muis-negatieve controle - kort haarspeld-RNA (shRNA) en shRNA Epas1 / Hif2α werden gekocht bij Santa Cruz Biotechnology (Texas, VS).C2C12-myotubes werden getransfecteerd met shRNA (1 nM) met behulp van in vitro transfectiereagens (Yeasen, Shanghai, China) volgens de instructies van de fabrikant.Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de gastrocnemius-spier van muizen en de C2C12-myotubes met behulp van Trizol (Invitrogen, Californië, VS) volgens de instructies van de fabrikant.Vervolgens werd het geëxtraheerde RNA omgekeerd getranscribeerd in cDNA met PrimeScript RT Master Mix (TAKARA-biotechnologie, Dalian, China).cDNA werd gekwantificeerd door SYBR green real-time PCR met 500 nM primers met behulp van een QuantStudio™ 5 (Thermo Fisher).Gapdh werd gebruikt als referentiegenen.De primersequenties die voor RT-qPCR worden gebruikt, zijn als volgt: Gapdh: F: TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA, R: GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT;Gpx4: F: GATGGAGCCCATTCCTGAACC, R: CCCTGTACTTATCCAGGCAGA;Ncoa4: F: GAACCATCAGGACACATGGAAA, R: AGGAGCCATAGCCTTGGGT;Slc7a11: F: GGCACCGTCATCGGATCAG, R: CTCCACAGGCAGACCAGAAAA;Slc3a2: F: CGTCCTGCAACCAAGAACTC, R: TCGTACAGCAGCGGAAGT;Tfr1: F: TCGTACAGCAGCGGAAGT, R: TCTCCACGAGCGGAATACAG;Acls4: F: CTCACCATTATATTGCTGCCTGT, R: TCTCTTTGCCATAGCGTTTTTCT;Lpcat3: F: GACGGGGACATGGGAGAGA, R: GTAAAACAGAGCCAACGGGTAG.Relatieve genexpressie ten opzichte van controle werd berekend met behulp van de formule: 2−ΔΔCT=2sample−ΔCT/2Ctrl-CT.Gastrocnemius-spieren en C2C12-myotubes werden gehomogeniseerd in radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysisbuffer (Solarbio, Beijing, China) met protease- en fosfataseremmers (Macgene, Beijing, China) gedurende 30 minuten op ijs en vervolgens gecentrifugeerd bij 10.000 g gedurende 10 minuten bij 4 °C.Het eiwit in het supernatant werd gemeten met behulp van een BCA-assay.Ongeveer 30 g eiwit van elk monster werd gescheiden door 10% SDS-PAGE en overgebracht op een PVDF-membraan (Merk Millipore, Duitsland).De membranen werden vervolgens achtereenvolgens geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen.Eiwitsignalen werden gedetecteerd met behulp van Immobilon Western Chemiluminescent HRP-substraat (Merk Millipore).De antilichamen omvatten GAPDH (sc-47742, Santa Cruz Biotechnology, Texas, VS) (1:1000), snelle skeletachtige myosine zware ketens (MyHC) (GB112130, Servicebio, Wuhan, China) (1:1000), langzame skeletachtige MyHC ( GB111857, Servicebio, Wuhan, China) (1:1000), MuRF1 (bs-2539R, Bioss, Peking, China) (1:1000), Atrogin1 (bsm-54451R, Bioss, Peking, China) (1:1000), GPX4 (AF7020, Beyotime, Shanghai, China) (1:1000), GDF8/myostatin (ab203076, Abcam, Cambridge, VK) (1:1000) en hypoxie-induceerbare factor (HIF) 2α (57921, Cell Signaling Technology, MA, VS) (1:1000).7-aminoactinomycine D (7-AAD) wordt vaak gebruikt om dode cellen te kleuren en uit te sluiten in flowcytometrie.21 C2C12-myotubes werden geoogst en gekleurd met 7-AAD (BioLegend, Californië, VS) gedurende 30 minuten bij 4 ° C, en vervolgens tweemaal gewassen met voorgekoelde PBS.De C2C12-myotubes werden onmiddellijk geanalyseerd met behulp van een CytoFlex LX-flowcytometer (Beckman Coulter, CA, VS) en geanalyseerd met FlowJo (Tree Star, San Carlos, Californië, VS).Cellulair Fe2+ werd gedetecteerd door FerroOrange (MX4559, Maokangbio, Shanghai, China).FerrOrange is een fluorescerende sonde die specifiek Fe2+ detecteert, dat zich voornamelijk in het endoplasmatisch reticulum bevindt.Als FerroOrange eenmaal reageert met Fe2+, kan het onomkeerbaar een oranje fluorescerend product (Absmax=542 nm, FLmax=572 nm) genereren.De C2C12-myotubes werden 3 keer gewassen in een serumvrij medium en vervolgens werd 1 M FerrOrange gedurende 30 minuten bij 37 ° C aan het medium toegevoegd.Het niveau van Fe2+ werd gedetecteerd met behulp van een CytoFlex LX flowcytometer.De niveaus van GSH en geoxideerd glutathion (GSSG) werden gemeten met behulp van een GSH- en GSSG-assaykit (S0053, Beyotime, Shanghai, China) volgens de instructies van de fabrikant.GSSG wordt gereduceerd tot GSH door glutathionreductase, dat kan reageren met het chromogene substraat DTNB om geel TNB en GSSG te produceren.De hoeveelheid totaal glutathion, die werd berekend met spectrofotometer A412, bepaalde de hoeveelheid gele TNB.Het gehalte aan GSSG werd vervolgens bepaald met behulp van reagentia om GSH in monsters te verwijderen.Het niveau van GSH werd berekend door GSSG af te trekken van het totale glutathion.De waarden van GSH werden genormaliseerd door eiwitconcentratie.Het niveau van lipide ROS in C2C12-myotubes werd gedetecteerd door het levende celanalysereagens C11-BODIPY581/591 (C10445, Thermofisher, Massachusetts, VS).In het kort, na behandeling met CSE en/of medicijnen werden de C2C12-myotubes geoogst en vervolgens gelabeld met C11-BODIBY581/591 (10 M) en gedurende 30 minuten bij 37 ° C in het donker geïncubeerd.Vervolgens werden C2C12-myotubes 3 keer gewassen met 1 × PBS, gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in 500 L PBS voor detectie door flowcytometer en laserconfocale microscopie.Het lipideperoxide (LPO) -niveau in lysaten van skeletspieren en C2C12-myotubes werd gedetecteerd met behulp van een lipideperoxidatietestkit (E-BC-K176, Elabscience, Wuhan, China) volgens het protocol van de fabrikant.In zure omstandigheden reageerde LPO met chromogene reagentia om de stabiele chromogene groep te genereren bij 45°C gedurende 60 minuten, gevolgd door centrifugatie bij 1100 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Het niveau van de stabiele chromogene groep in supernatanten werd colorimetrisch gekwantificeerd bij OD586.De waarde van LPO werd genormaliseerd door eiwitconcentratie gedetecteerd door de BCA-methode.mRNA-sequencing werd uitgevoerd met skeletspieren van muizen (GEO: GSE197463) en mensen (GEO: GSE100281).Genexpressieanalyse werd uitgevoerd met behulp van R-pakketten ggplot2 (v3.3.5).Correlatieanalyse werd uitgevoerd met behulp van de M-functie in corrplot (v0.90).Gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD Unpaired Student's t-test (twee groepen) of eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) (meer dan twee groepen) werd uitgevoerd om statistische verschillen tussen groepen te evalueren met SPSS 20.0-software (IBM Corporation, Armonk, New York, VS).p<0,05 werd als een statistisch significant verschil beschouwd.Na 24 weken aan CS te zijn blootgesteld, vertoonden de muizen typische veranderingen die consistent waren met COPD.Longfunctiemetingen toonden een significante toename van de luchtwegweerstand (RL) (Figuur 1A) maar een significante afname van de longcompliantie bij CS-blootgestelde muizen (Figuur 1B).Vergeleken met controles vertoonden CS-blootgestelde muizen ook een toename in FVC (Figuur 1C), maar significante dalingen in FEV0.1, FEV0.1/FVC en FEF25-75% (Figuur 1D-F).Histologische longanalyse toonde beschadigde alveolaire wanden en vergroting van de luchtwegen (Figuur 1G), zoals aangetoond door verhoogde MLI en DI in CS-blootgestelde muizen (Figuur 1H en I).Bovendien was er ook een duidelijke ontstekingsinfiltratie in het longparenchym en interstitiële ruimten (Figuur 1G).Neutrofielen en eosinofielen waren ook verhoogd in BALF van aan CS blootgestelde muizen (Figuur 1J).We evalueerden de spierkracht van de vier ledematen van de muizen en de resultaten toonden een duidelijke afname van de grijpkracht (Figuur 1K), vergezeld van een smallere dwarsdoorsnede van myovezels en lossere textuur van gastrocnemius-spieren (Figuur 1L) in CS -blootgestelde muizen in vergelijking met de controlegroep.Als een krachtige negatieve regulator van spiermassa, werd de myokine MSTN opwaarts gereguleerd in skeletspieren van muizen17 en patiënten met COPD22 en wordt aangenomen dat het een vitale rol speelt bij COPD-gerelateerde skeletspierdisfunctie.23 Hier bevestigden we dat de expressies van MSTN, MuRF1 en Atrogin1 waren verbeterd in de spieren van CS-blootgestelde muizen (Figuur 1M).De COPD-muizen vertoonden ook een verlaagde MyHC van het slow-twitch-vezeltype, maar een verhoogde MyHC van het fast-twitch-vezeltype (Figuur 1M en N), wat consistent was met de bevindingen van COPD-patiënten.4Figuur 1 Langdurige blootstelling aan CS leidde tot emfyseem en skeletspierdisfunctie.(AF) Luchtwegweerstand (RL), longcompliantie, FVC, FEV0.1, FEV0.1/FVC en FEF25-75% werden gemeten bij muizen;(G) H & E-kleuring van longweefsels van muizen die zijn blootgesteld aan lucht en CS;Pijlen (links) geven vernietiging van de alveolaire wand aan;Pijl (rechts) geeft aan dat ontstekingscellen infiltreren in het longparenchym en interstitiële ruimten;De schaal in elke afbeelding is 100 m;(H en I) histogram van MLI en DI;(J) FACS toonde de neutrofielen (CD11B+Ly6G+) en eosinofielen (CD11B+SiglecF+) in BALF;(K) histogram van grijpkracht;(L) H & E-kleuring van spieren van muizen die zijn blootgesteld aan lucht en CS;Pijlen geven veranderingen in spiervezels en verbreding van hiaten aan;De schaal in elke afbeelding is 100 m;(M) WB toonde de eiwitexpressie van Slow MyHC, Fast MyHC, MuRF1, Atrogin1 en MSTN in luchtspieren en CS-blootgestelde muizen;(N) de expressie van Slow MyHC in spieren van muizen.n = 5, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.Figuur 1 Langdurige blootstelling aan CS leidde tot emfyseem en skeletspierdisfunctie.(AF) Luchtwegweerstand (RL), longcompliantie, FVC, FEV0.1, FEV0.1/FVC en FEF25-75% werden gemeten bij muizen;(G) H & E-kleuring van longweefsels van muizen die zijn blootgesteld aan lucht en CS;Pijlen (links) geven vernietiging van de alveolaire wand aan;Pijl (rechts) geeft aan dat ontstekingscellen infiltreren in het longparenchym en interstitiële ruimten;De schaal in elke afbeelding is 100 m;(H en I) histogram van MLI en DI;(J) FACS toonde de neutrofielen (CD11B+Ly6G+) en eosinofielen (CD11B+SiglecF+) in BALF;(K) histogram van grijpkracht;(L) H & E-kleuring van spieren van muizen die zijn blootgesteld aan lucht en CS;Pijlen geven veranderingen in spiervezels en verbreding van hiaten aan;De schaal in elke afbeelding is 100 m;(M) WB toonde de eiwitexpressie van Slow MyHC, Fast MyHC, MuRF1, Atrogin1 en MSTN in luchtspieren en CS-blootgestelde muizen;(N) de expressie van Slow MyHC in spieren van muizen.n = 5, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.Celdood is een van de belangrijke mechanismen die de orgaan- of weefselfunctie beïnvloeden, dus hebben we de doodspatronen van skeletspiercellen bij COPD onderzocht.Eerst werd RNA-sequencing uitgevoerd op skeletspieren van muizen (GEO: GSE197463) en COPD-patiënten24 (GEO: GSE100281) geanalyseerd.De resultaten toonden aan dat de ferroptosis-route significant was verrijkt bij COPD-patiënten (Figuur 2A), en dat Gpx4 en nucleaire receptor-coactivator (Ncoa4) die respectievelijk ferroptosis kunnen remmen en bevorderen, ontregeld waren in CS-blootgestelde muizen (Figuur 2B en C) .Daarom onderzochten we vervolgens enkele belangrijke ferroptose-gerelateerde moleculen in skeletspieren van onze COPD-muizen.We ontdekten dat de expressie van GPX4 was verminderd in spieren van aan CS blootgestelde muizen in vergelijking met de controlemuizen (Figuur 2D-F).Bovendien werden de mRNA-niveaus van de cystinetransporter Slc7a11, transferrinereceptor 1 (Tfr1) en Ncoa4 opgereguleerd in CS-blootgestelde muizen (Figuur 2D).Figuur 2 Chronische blootstelling aan CS veroorzaakte ferroptosis in skeletspieren van muizen.(A) Celdood was verrijkt in skeletspieren van COPD-patiënten en gezonde controle door GSEA.(B en C) Genexpressie van Gpx4 en Ncoa4 in skeletspieren van muizen door RNA-sequencing;(D) RT-qPCR onderzocht de expressie van Gpx4, Slc7a11, Tfr1 en Ncoa4 in spieren;(E) WB toonde de eiwitexpressie van GPX4 in spieren;(F) IF toonde de expressie van GPX4 in spieren van muizen die waren blootgesteld aan lucht en CS;De schaal in elke afbeelding is 50 m;(G) het gehalte aan GSH in spieren;(H) het niveau van LPO in spieren bepaald door colorimetrie;(I) IF toonde de expressie van 4-HNE in spieren van muizen die waren blootgesteld aan lucht en CS;De schaal in elke afbeelding is 50 m.n = 5, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.Figuur 2 Chronische blootstelling aan CS veroorzaakte ferroptosis in skeletspieren van muizen.(A) Celdood was verrijkt in skeletspieren van COPD-patiënten en gezonde controle door GSEA.(B en C) Genexpressie van Gpx4 en Ncoa4 in skeletspieren van muizen door RNA-sequencing;(D) RT-qPCR onderzocht de expressie van Gpx4, Slc7a11, Tfr1 en Ncoa4 in spieren;(E) WB toonde de eiwitexpressie van GPX4 in spieren;(F) IF toonde de expressie van GPX4 in spieren van muizen die waren blootgesteld aan lucht en CS;De schaal in elke afbeelding is 50 m;(G) het gehalte aan GSH in spieren;(H) het niveau van LPO in spieren bepaald door colorimetrie;(I) IF toonde de expressie van 4-HNE in spieren van muizen die waren blootgesteld aan lucht en CS;De schaal in elke afbeelding is 50 m.n = 5, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.Ferroptose wordt veroorzaakt door verminderde antioxidantcapaciteit en dodelijke accumulatie van LPO, en consequent vonden we verminderde GSH maar verhoogde LPO bij CS-blootgestelde muizen in vergelijking met de controlemuizen (Figuur 2G en H).Ook werd 4-hydroxynonenal (4-HNE), een belangrijke marker van LPO, geaccumuleerd in spierweefsels van aan CS blootgestelde muizen (Figuur 2I).Al met al bevestigden deze bevindingen dat blootstelling aan CS ferroptose van skeletspieren induceerde, die mogelijk betrokken is bij skeletspierdisfunctie bij COPD-muizen.Nadat C2C12-myoblasten gedurende 5 dagen waren geïnduceerd met een medium dat 2% paardenserum bevatte, fuseerde de meerderheid van de myoblasten om C2C12-myotubes te vormen (Figuur 3A), die werden gebruikt voor daaropvolgende onderzoeken in vitro.Om het directe effect van CSE op myotubes te bepalen, werd 7AAD gebruikt om te bepalen of CSE de dood van myotubes veroorzaakte.We ontdekten dat het sterfteaandeel van C2C12-myotubes was verhoogd in CSE-gestimuleerde cellen (Figuur 3B).Vergeleken met de blanco controles vertoonden de CSE-gestimuleerde myotubes een verhoogd niveau van Slc7a11, maar verlaagde niveaus van Gpx4, Slc3a2, Tfr1, Ncoa4, acyl-CoA-synthetase-familielid met lange keten 4 (Acls4) en lysofosfatidylcholine-acyl3transferase 3 (Lpcat ) (Figuur 3C).GSH, een van de belangrijkste antioxidanten die schade aan belangrijke cellulaire componenten veroorzaakt door ROS kan voorkomen, kan worden gereguleerd door GPX4 die GSH omzet in GSSG en de cytotoxische lipideperoxiden (L-OOH) reduceert tot de overeenkomstige alcoholen (L-OH) .Hier vonden we dat GPX4-expressie was afgenomen in CSE-behandelde C2C12-myotubes (Figuur 3D), wat consistent was met de resultaten in spieren van aan CS blootgestelde muizen.Merk op dat we ook vonden dat de expressies van MuRF1, Atrogin1 en MSTN waren verbeterd in CSE-gestimuleerde myotubes (Figuur 3D).Figuur 3 CSE-stimulatie veroorzaakte ferroptosis in C2C12-myotubes.(A) Cellulaire morfologie van C2C12-myoblasten en C2C12-myotubes.De schaal in elke afbeelding is 100 m;(B) het aandeel van celdood werd gedetecteerd door flowcytometrie met 7AAD-kleuring in Ctrl en 3% CSE-gestimuleerde myotubes;(C) RT-qPCR onderzocht de expressie van Gpx4, Slc7a11, Slc3a2, Tfr1, Ncoa4, Acls4 en Lpcat3 in C2C12-myotubes;(D) WB toonde de eiwitexpressie van GPX4, MuRF1, Atrogin1 en MSTN in C2C12-myotubes;(E) het niveau van Fe2+ werd gedetecteerd door flowcytometrie met de fluorescerende sonde;(F) het gehalte aan GSH in C2C12-myotubes;(G) lipide ROS werd gedetecteerd door flowcytometrie met C11 BODIPY;(H) het niveau van LPO in C2C12-myotubes.(I) Het aandeel van celdood werd gedetecteerd door flowcytometrie met 7AAD-kleuring.UAMC-3203, een ferroptose-remmer.***P < 0,001, ****P < 0,0001.Figuur 3 CSE-stimulatie veroorzaakte ferroptosis in C2C12-myotubes.(A) Cellulaire morfologie van C2C12-myoblasten en C2C12-myotubes.De schaal in elke afbeelding is 100 m;(B) het aandeel van celdood werd gedetecteerd door flowcytometrie met 7AAD-kleuring in Ctrl en 3% CSE-gestimuleerde myotubes;(C) RT-qPCR onderzocht de expressie van Gpx4, Slc7a11, Slc3a2, Tfr1, Ncoa4, Acls4 en Lpcat3 in C2C12-myotubes;(D) WB toonde de eiwitexpressie van GPX4, MuRF1, Atrogin1 en MSTN in C2C12-myotubes;(E) het niveau van Fe2+ werd gedetecteerd door flowcytometrie met de fluorescerende sonde;(F) het gehalte aan GSH in C2C12-myotubes;(G) lipide ROS werd gedetecteerd door flowcytometrie met C11 BODIPY;(H) het niveau van LPO in C2C12-myotubes.(I) Het aandeel van celdood werd gedetecteerd door flowcytometrie met 7AAD-kleuring.UAMC-3203, een ferroptose-remmer.***P < 0,001, ****P < 0,0001.Overmatige accumulatie van intracellulair Fe2+ kan de productie van lipide ROS direct katalyseren via de Fenton-reactie, en uiteindelijk ferroptosis veroorzaken.Daarom hebben we Fe2+ in myotubes gedetecteerd door Fe2+ fluorescerende sondes, en een significant verhoogd niveau van Fe2+ gevonden in C2C12 myotubes behandeld met CSE (Figuur 3E).Verder werd een significante afname van GSH (Figuur 3F) maar een duidelijke toename van lipide ROS (Figuur 3G) en LPO (Figuur 3H) waargenomen in CSE-gestimuleerde C2C12-myotubes.Om het optreden van ferroptosis verder te bevestigen, ontdekten we dat het sterfteaandeel van C2C12-myotubes geïnduceerd door CSE aanzienlijk werd verlicht na interventie met de ferroptose-remmer UAMC-3203 (Figuur 3I).Aangezien CSE de opregulatie van MSTN induceerde, vroegen we of CSE ferroptosis veroorzaakte via MSTN.Om deze hypothese te testen, gebruikten we een MSTN-blokker TEW-7197, die de binding van MSTN aan zijn receptor ALK4/5 zou kunnen remmen in ons myotubes-model.Am J Respir Crit Care Med.Am J Respir Crit Care Med.Am J Respir Crit Care Med.Am J Respir Crit Care Med.BMC kanker.Alle rechten voorbehouden.